La biodiversidad puede ser expresada como riqueza de especies, diversidad de especies, diversidad genética y/o diversidad funcional (Heywood & Iriondo, 2003). La gran diversidad y el corto tiempo generaciónal que presenta la microfauna (protozoarios y nematodos) los hacen indicadores ideales de cambios en las condiciones del suelo (Ritz & Trudgill, 1999). Los estudios de diversidad para nematodes estan basados, principalmente, en la determinación taxonómica por la observación de los caracteres morfológicos clave para el reconocimiento de los diferentes grupos. Por ello, para este tipo de estudios es necesaria la participación de especialistas entrenados en la taxonomia de nematodes. Sin embargo, la determinación de la morfología taxonómica lleva un largo tiempo de observación, lo que puede limitar estudios, particularmente cuando se trabaja con muestras de ambientes con alta diversidad biológica. Por ello es necesario desarrollar metodos rapidos, estandarizados y que permitan trabajar con elevado numero de muestras simultaneamaente para monitorear la fauna nematológica del suelo, considerando que los métodos moleculares proporcionan una alternativa a la identificación morfológica tradicional (André et al., 2002), e también una alternativa al tiempo consumido por los métodos tradicionales de la identificación faunal. La primera fase en el desarrollo de una técnica molecular es obtener un método efectivo de extracción de ADN, para obtener un material con alta concentración y bajo o nulo grado de degradación, que pueda ser utilizado para amplificar regiones de interés por la reacción de la cadena polimerasa (PCR). Sin embargo, cuando las muestras provienen de ambientes con elevado contenido de materia orgánica, muchas veces si bien la extracción de ADN puede haber resultado exitosa, se extraen junto con el material genético sustancias del ambiente que pueden inhibir las reacciones de PCR. Aquí se evalúan algunos métodos de extracción de ADN usando los nematodos como un grupo modelo de las comunidades del suelo. El estudio fue conducido en la Pampa Austral (Región Mar y Sierras) sobre parcelas de un experimento de rotaciones mixtas y secuencias de cultivos de larga duración (30 anos), en la Unidad Integrada Balcarce (Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Mar del Plata -Estación Experimental Agropecuaria, I N T A) Balcarce, Buenos Aires, Argentina. Los tratamientos, estudiados pertenecen a dos sistemas de labranza (siembra directa y sistema convencional), con dos rotaciones (rotación agricultura-pastura y rotación agricultura continua) y una condición de fertilización, con dosis de nitrogeno (N) de 120 kg N ha-1 en la forma de urea. Se realizaron tres muestreos: invierno de 2006, verano de 2006 y primavera de 2007. Las muestras se tomaron con muestreador a una profundidad de 20 cm utilizando el metodo sistematico de muestreo en liña zig-zag. Para la extración de los nematodes del suelo, fue implementado la tecnica de flutuación-centrifugación como descripto por Caveness & Jensen, (1955). Fueron utilizados los siguientes métodos de extracción de ADN: 1) Macerado directo en 0,5 mL buffer TE (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0] buffer, 1% β-mercaptoetanol); 2) Macerado y digestión en SDS (1% Sodium Dodecyl Sulfate), 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 100μg /ml proteinasa K, 1% β-mercaptoetanol, 100 mM Tris-HCl pH 8,5), y extracción final con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, pH=8); 3) Macerado en resina Chelex (20% Biorad-100) y buffer TE; y 4) Macerado en buffer CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide 2%) en buffer TE y 100μg /ml proteinasa K, 1% β-mercaptoetanol con extracción final con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, pH=8). En todos los protocolos, exeptuando macerado directo, las muestras a las cuales se realizo la extracción de ADN fueron: 1) muestras sucias (nematodes con residuos de materia orgánica) y 2) muestras limpias (en las cuales los nematodes fueron “pescados” y transferidos a un nuevo recipiente con buffer TE). Luego de la extracción de ADN se cuantificó la concentración y la calidad del ADN (18S) extraído midiendo la absorbancia a 260 nm y la relación 260/280 nm respectivamente, utilizando el espectro Biorad Smart Spec 3000. Todas las muestras fueron sometidas a la amplificación de regiones del 18S rADN extraído de los nematodes. Para ello fueron utilizados los siguientes pares de primers: NemF1/S3, NemF1/Nem896, NS1/NS4 (http://www.nematodes.org/barcoding/sourhope/nemoprimers.html). Para todos los métodos de extracción de ADN utilizados fue medida Se consiguió obtener concentraciones de ADN que varió de 20 ng a 315 ng y la calidad del mismo varió entre 0,7447 y 1,9852, siendo obtenidos los mayores valores de calidad con el método 4 (1,3263 a 1,9852). Además este método, aplicado a las muestras limpias, fue el único que amplificó utilizando los tres pares de primer, en los cuales se han obtenidos amplificados de 600 bp, 700 bp y 1200 bp para los primers NemF1/S3, NemF1/Nem896 y NS1/NS4 respectivamente. Dichos tamaños de amplificados han sido los esperados según la bibliografía y están siendo actualmente utilizados para generar librerías genómicas y patrones de RFLP.
Asociación Argentina de Biología y Ecología del Suelo